实时荧光定量PCR（Real-TimePCR，简称qPCR）是一种基于聚合酶链式反应（PCR）的高灵敏度、高特异性的分子生物学技术，用于定量分析DNA或RNA的含量。它通过实时监测PCR反应过程中产生的荧光信号的变化来实现对靶标核酸的定量分析。
原理定义：
实时荧光定量PCR系统的原理基于PCR反应的扩增过程，在此过程中利用荧光染料或荧光探针对PCR产物进行实时检测和定量。
PCR扩增过程：
通过PCR扩增反应，DNA模板经过多个循环逐步扩增，生成大量的目标DNA片段。
在每一个循环中，模板DNA会被热变性（使双链DNA分开）、退火（引物与模板配对）和延伸（DNA聚合酶合成新链）等步骤逐渐扩增。
荧光信号的产生：
在扩增过程中，荧光染料或探针与PCR产物结合，产生荧光信号。实时PCR系统通过监测这些荧光信号的变化来判断目标核酸的数量。
常用的荧光探针和染料包括：
SYBRGreen：与双链DNA结合时发出荧光，适用于检测PCR产物。
TaqMan探针：是一种带有荧光基团和猝灭基团的探针，只有当探针与目标DNA结合并在PCR反应过程中被DNA聚合酶切割时，才会释放荧光信号。
MeltCurve分析：通过熔解曲线分析，可以进一步确认PCR产物的特异性。
实时检测和定量：
在每一轮PCR扩增的过程中，实时荧光定量PCR系统都会在每一个扩增周期结束时，检测荧光信号的强度。
荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，因此可以通过荧光信号的变化曲线来推算目标核酸的初始浓度。
在PCR反应的指数扩增阶段，荧光信号与目标DNA的量呈指数关系，系统可以通过分析信号的上升曲线（Ct值，临界阈值）来定量目标DNA或RNA的浓度。
定量分析：
Ct值（阈值循环数）：是指PCR反应中，荧光信号达到预设的阈值时的循环数。Ct值与样本中的初始靶标DNA/RNA浓度成反比，Ct值越小，表示初始模板的浓度越高。
标准曲线法：使用已知浓度的标准品构建标准曲线，根据样本的Ct值对其进行定量。
相对定量：可以通过对照基因或内参基因的表达量与目标基因的表达量进行比对，得出目标基因的相对表达量。
优点：
高灵敏度与高特异性：通过实时监测荧光信号，可以在PCR扩增的初期阶段检测到目标核酸，具有很高的灵敏度和特异性。
定量精准：实时监测每一个PCR循环中的荧光信号，可以精确地定量目标核酸的初始含量。
无需后期电泳：与传统的PCR方法不同，实时荧光定量PCR不需要使用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，减少了操作时间和误差。
应用：
基因表达分析：用于检测基因的相对或绝对表达量。
病原检测：如病毒、细菌等的定量检测。
基因突变分析：检测特定基因的突变。
定量检测DNA、RNA：适用于定量DNA或RNA模板，包括mRNA、miRNA、DNA甲基化等。
实时荧光定量PCR为分子生物学研究和临床应用提供了强大的工具，尤其是在基因表达、疾病诊断和环境监测等领域。
